表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组病毒的构建与鉴定

狂藏獒病是一种严重威胁人类健康，但尚无法治疗的恶性传染病，唯有疫苗能有效地控制该病的发生。由于当前使用的组织培养狂犬疫苗存在生产成本高、副反应大、热稳定性差等诸多缺点，因此，迫切需要研制高效、安全、价廉的基因工程疫苗，以满足市场的需求。国外和本室相继报道，表达狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein, RG)的重组痘苗病毒，具有良好的免疫效果［1，2］。虽然痘苗病毒作为基因工程疫苗载体具有许多优越性，然而，其罕见严重的并发症限制了它更广泛地应用。近年来，随着MVA、NYVAC、ALVAC等非复制型痘病毒载体的问世，痘病毒的安全问题已基本得以解决［3］。1994年，中国预防医学科学院病毒学研究所阮力实验室成功地构建了一系列质粒，能定点删除痘苗病毒天坛株中与毒力相关的核酸片段，极大地降低了痘苗病毒的毒力［4］。本研究按人用疫苗标准设计，利用这些质粒进行删除工作。首先，选择能诱生中和抗体的RG基因作为靶基因，将其插入痘苗病毒天坛株的TK区，然后删除痘苗病毒基因组CK片段间与痘苗病毒毒力及宿主范围相关的基因，获得了非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK。现对其减毒特性和免疫原性进行报道。 

1　材料和方法 

1.1　质粒与菌株　质粒pJSB1 175, pNeoCKLacZ, pNeoCK由中国预防医学科学院病毒学研究所遗传室提供［4］。pNeoCKLacZ和pNeoCK用于删除痘苗病毒基因组C、K片段间与毒力和宿主范围相关基因。pBluescript-RG, E. coli DH5α由本室保存。 

1.2　病毒和细胞　痘苗病毒V1 175，为TK区插入LacZ基因的重组病毒，由本室提供［5］；人TK143细胞由中国预防医学科学院病毒所遗传室提供；原代鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)用9日龄鸡胚，按常规方法制备。 

1.3　酶与试剂　限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、lipofectin转染试剂盒均购Gibco. BRL公司；Taq酶购自华美生物工程公司；地高辛DNA标记及检测试剂盒购自Borhinger Mannhim公司；G418购自Sigma公司；抗RG单克隆抗体由美国CDC Dr. Smith惠赠；荧光标记羊抗鼠IgG抗体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG抗体由本所免疫室提供。引物1和引物2由病毒所遗传室提供，分别为痘苗病毒天坛株C片段和K片段的两段核苷酸序列，因该缺失载体正在申请专利，具体序列暂不便公开。其他化学试剂均为国产AR级。 

1.4　重组质粒pJSB1 175RG的构建参照文献［6］。 

1.5　重组痘苗病毒VTKRG的构建、筛选 及纯化　利用pJSB1 175RG与痘苗病毒V1 175在CEF中进行同源重组，将RG基因送至痘苗病毒的TK区，具体方法见文献［5］。 

1.6　重组病毒VTKRG中RG基因的检测　常规方法提取痘苗病毒DNA［7］，与地高辛标记的RG cDNA探针杂交，具体操作见试剂盒说明书。 

1.7　非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK的构建、筛选及鉴定　以0.01pfu/cell的VTKRG感染90%成片的CEF，37℃吸附1小时后，利用lipofectin将质粒pNeoCKLacZ导入细胞，37℃培养60～72小时后，收获病毒，冻融3次作为重组液。将重组液在含G418 400 μg/ml的CEF中连续传3代；然后在无G418的CEF中传2～3代。将如此处理的重组液感染CEF，37℃培养72小时后铺入含有X-gal和中性红的营养琼脂，随机挑选若干个孤立的蓝病毒斑于含2%小牛血清的维持液中冻融3次。根据它们在CEF和TK143细胞中生长特性进行筛选［8］。将筛选出的VTKRG△CKLacZ与质粒pNeoCK在CEF中进行同源重组，构建VTKRG△CK，方法同前，将挑取的白病毒斑扩增后提取其DNA，以PCR方法进行鉴定。循环参数为：95℃预变性5分钟，95℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，共30个循环，72℃10分钟。 

1.8　VTKRG△CK在CEF和TK143细胞中生长特性比较　以相同的病毒量同时感染CEF和TK143细胞，37℃培养72小时，染色计数。 

1.9　VTKRG△CK表达产物的检测　间接免疫荧光法和Western blot按常规方法进行［7］。 

1.10　小鼠中和抗体测定和攻击试验　于0，7天以0.3 ml(2×108pfu/ml)的VTKRG△CK皮下免疫小鼠2次。于14天、21天、28天采血，以小鼠中和实验(mouse neutralizing test, MNT)测定其中和抗体［9］，第21天以10LD50CVS株狂犬病毒肌肉攻击小鼠，观察保护效果。同时，以VTKRG及痘苗病毒天坛株免疫小鼠作为对照。 

2　结果 

2.1　非复制型重组病毒VTKRG△CK的构建与鉴定 

2.1.1　复制型重组病毒VTKRG的构建与鉴定　RG是狂犬病毒5种结构蛋白中唯一能诱生中和抗体的组分，RG基因开放阅读框架全长1 575 bp，编码505个氨基酸的成熟糖蛋白及N-端19个氨基酸的信号肽。将pBluescriptRG中的RV5aG株的RG基因克隆至pJSB1 175质粒中，使RG的表达受P7.5启动子的控制(图1)。构建成重组质粒pJSB1 175RG, 以V1 175为亲本毒种，pJSB1 175RG作为转染质粒，通过二者在CEF中发生同源重组，RG取代TK区的LacZ基因，即从蓝斑中挑选白斑筛选重组病毒。重组病毒经纯化、扩增后，提取VTKRG DNA，以天坛株DNA作为阴性对照，以质粒pJSB1 175RG为阳性对照，打点至硝酸纤维膜上。以地高辛标记的RG基因作为探针进行杂交。结果显示，重组病毒中有RG基因的存在(图2)。 

图1　pJSB1 175RG的结构 

图2　斑点杂交检测VTKRG中的RG基因 

2.1.2　VTKRG△CK的构建与鉴定　首先将pNeoCKLacZ与VTKRG共转染CEF，利用G418-Neo(选择压力)和蓝白斑筛选标记，可得到含有全部质粒序列的中间重组体。去除G418(压力)后，其内部同源序列间发生第二次同源重组，即可获得VTKRG△CKLacZ，基因组中的大部分C、K片段已经缺失，被LacZ取代。为了从VTKRG△CKLacZ中删除LacZ基因，达到人用疫苗研制的要求，再将VTKRG△CKLacZ与质粒pNeoCK在CEF中进行同源重组，用质粒中的CK结构取代病毒中的LacZ, 以获得VTKRG△CK。由于重组病毒缺失了CK间大部分基因，采用引物1和引物2，通过PCR方法可以扩增出一小片段(图 3)。而未缺失的痘苗病毒因其CK间片段过长，无法扩增。PCR结果还表明，VTKRG△CK在CEF中连续传15代后，病毒的缺失区域仍非常稳定。 

图3　非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK P5，P10 和P15中 C-K基因片段的PCR扩增结果 

2.2　VTKRG△CK在CEF及TK143中的生长特性　痘苗病毒CK区缺失后，其生长特性发生一些改变，如病毒的宿主范围变窄。以相同的病毒量感染CEF和TK143细胞，培养72小时，可见VTKRG△CK在CEF中正常繁殖，出现许多病毒斑。但在TK143中未出现明显的病变(图4)。 

图4　VTKRG△CK在CEF及TK143中生长特性的比较 

2.3　VTKRG△CK表达产物的检测　间接免疫荧光结果显示，VTKRG△CK能有效地表达RG，表达产物主要分布在细胞膜上(图5)。Western blotting表明，重组病毒表达的RG，酶染后呈一条带，分子量约为65 kD，与文献报道一致，说明CK间片段的缺失并未影响RG的表达(图6)。 

图5　间接免疫荧光法检测VTKRG△CK感染的 CEF细胞膜上表达的RG 

表1　重组痘苗病毒VTKRG△CK免疫小鼠效果观察 

图6　Western blot检测RG的表达 

2.4　VTKRG△CK的免疫效果　见表1，VTKRG△CK免疫小鼠，初次免疫后14天，中和抗体的滴度为1∶13，21天中和抗体的滴度上升为1∶151。第21天用10LD50CVS株狂犬病毒肌肉攻击，重组病毒免疫组小鼠全部获得保护；对照组小鼠全部死亡。VTKRG△CK诱生的中和抗体水平和免疫保护效果与VTKRG的相似，表明CK区 缺失对VTKRG△CK的免疫原性没有影响。 

3　讨论 

非复制型痘病毒载体为彻底解决痘病毒的安全问题，提供了一条新途径。这类载体在哺乳动物细胞中不能完成其复制周期，不产生子代病毒颗粒，但可以有效地表达外源抗原，极大地提高了痘病毒载体的安全性［10］。本研究构建了表达狂犬病毒糖蛋白的非复制型重组痘苗病毒VTKRG△CK。PCR证实，该病毒CK片段间涉及痘苗病毒毒力及部分宿主范围基因已经缺失。Western blot和IFA显示，CK区的缺失不影响VTKRG△CK表达RG。体外实验表明，VTKRG△CK的安全性有了明显提高。与VTKRG相比，VTKRG△CK的生长特性发生了一些改变，虽然二者在CEF中均能正常繁殖，但在大多数哺乳动物细胞中的生长特性截然不同，如VTKRG△CK在人源TK143细胞中几乎不增殖。以前的研究表明，随着重组痘苗病毒接种剂量的增加，小鼠出现毒副反应的机率亦增加，我们用VTKRG△CK以10倍于VTKRG的剂量免疫小鼠，获得了与VTKRG相同的免疫效果，中和抗体的水平和保护效果均与VTKRG相仿，而且免疫小鼠未出现由痘苗病毒引起的毒性反应。这说明VTKRG△CK较VTKRG更为安全。鉴于痘苗病毒的神经毒性能够引起1/107的人，特别是免疫缺陷患者出现进行性发痘和种痘后脑炎，因此我们拟在裸鼠和免疫抑制剂造成的免疫缺陷动物模型中，对VTKRG△CK的减毒特性进行深入研究，客观评价VTKRG△CK的有效性和安全性。