犬细小病毒血凝特性的研究

犬细小病毒和猫泛白细胞减少症病毒在PBS4℃条件下能凝集恒河猴、猪、马和猫的红细胞，不能凝集牛、绵羊、山羊、犬、兔、豚鼠、小鼠、地鼠、鸡、人O型和鹅的红细胞。在22℃、37℃，病毒血凝的敏感性降低，经2－3小时即从红细胞上解脱下来。红细胞浓度与CPV的HA滴度成反比，HI滴度则随着红细胞浓度的增加而平行升高。 

有些学者认为，犬细小病毒（CPV）、猫泛白细胞减少症病毒（FPV）和貂肠炎病毒（MEV）是同一病毒的变异株，因而将其划为同一病毒组。但CPV的血凝性显著不同于FPV、MEV。本试验的目的在于检测CPV、FPV在不同血凝条件下，对各种动物红细胞的凝集情况及CPV和FPV之间的抗原性差异，为检测犬粪便中的CPV和细胞培养物中的CPV滴度提供方法，并为应用CPV的吸附、解脱特性，提纯浓缩CPV提供依据。 

材料和方法 

一、血凝素： CPV－GN，在CRFK细胞上传代，HA效价＞2048，本所提供，可被 8单位HI抗体完全抑制，经电镜证实为典型CPV颗粒； FPV－8，在 FK8l细胞上传代， HA效价>1024，南京农大惠赠。 

二、阳性血清： CPV阳性血清，HI效价>1280。FPV阳性血清，HI效价>640，南京农大惠赠。 

三、0．5％红细胞：分别采取猪、恒河猴、马、猫、牛、绵羊、山羊、兔、犬、小鼠、豚鼠、地鼠、人0型、鸡和鹅的血液，注入3－5倍于血液量的阿氏液中，混匀，置4℃。使用前，先用生理盐水洗3次，每次300rpm 离心10分钟，每种血球泥分别用不同pH的BSA 配成0 5％悬液，置 4℃备用。 

四、HA试验：取96孔微量板，每孔滴加 0．015M PBS 0．025ml，用稀释棒醮取血凝素于第 1孔内，依次向后进行倍比稀释至第11孔内，每孔再滴加 PBS 0．025ml和 0．5％红细胞 0．05ml。振荡1分钟，分别置 4℃、 22℃、 37℃2小时，血凝程度以“=”、“卅”、“+”、“＋”、和“－”表示，即表示 100％、75％、50％、25％凝集和不凝集。其效价以能凝集 50％红细胞的最高稀释倍数表示。 

五、HI试验：在96孔微量板上，每孔滴加PBS 0．025ml，第12孔满加PBS 0．05ml，以稀释棒醮取0．025ml阳性血清于第1孔，依次倍比稀释至第10孔，在第 1－11孔滴加 0．025ml 8单位CPV，振荡 1分钟，置37℃，感作 1小时，取出，每孔加 0．5％红细胞OO5ml，振荡，置4℃，2小时，判定结果。HI效价以完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释倍数表示。 

六、交叉 HI试验：方法同 HI试验。应用已知 FPV阳性血清和经分离的 CPV免疫犬血清，分别对 CPV、FPV进行交叉 HI试验，计算HI效价，按照Archetti等的方法计算抗原比R值。 

结果 

一、CPV、FPV对不同种类红细胞、温度和pH的敏感性；CPV、FPV能很好凝集恒河猴、猪的红细胞，也能凝集马和猫的红细胞，CPV、FPV均不能凝集牛、绵羊、山羊、犬、兔、豚鼠、小鼠、地鼠、人 0型、鸡和鹅的红细胞。 CPV血凝的 pH值适应范围比 FPV广泛。两者最适pH为pH5.8一6.0,但CPV在pH5.8―7.4时，能很好凝集恒河猴和猪的红细胞。而当pH>6.0，FPV的血凝活性明显降低。CPV、FPV的血凝温度在4℃，2小时即能判读结果。在22℃、37℃，CPV也能凝集猪、恒河猴、马和猫的红细胞，但敏感性不如在4℃。而FPV在22℃、37℃对恒河猴、马的红细胞的凝集则更差。CPV和FPV在22℃、37℃，2－3小时后均从红细胞上解脱下来。 

恒河猴的红细胞比猪的红细胞对CPV凝集的重复性好，也较稳定。 

猪红细胞浓度与CPV的HA、HI效价的关系： 

猪红细胞浓度与 CPV的 HA效价成反比。红细胞浓度每增加 0． 5％，HA效价则约减少 1／2。 HI效价随着红细胞浓度的增加而平行增高，但不如HA效价对于红细胞浓度轻微变化那样敏感。 

三、CPV、FPV交叉 HI试验： 由实验所得数据经抗原比R值统统计结果证明，所分离的CPV与FPV在抗原上存在明显差异。 

小结与讨论 

1．CPV具有较强的血凝特性。在pH5.8一7.4范围内，能凝集恒河猴、猪、马和猫的红细胞。凝集温度在4℃优于22℃、37℃。FPV在4℃和pH5.8―6.4条件下，也能凝集猪、恒河猴和马的红细胞，但不能凝集猫的红细胞。当pH>6.4时，FPV的血凝活性急剧减弱。凝集在红细胞上的CPV或FPV，在22℃、37℃，于2―3小时均从红细胞上解脱下来。在本实验条件下，两种病毒均不能凝集牛、绵羊、山羊、兔、犬、小鼠、豚鼠、地鼠、人0型、鸡和鹅的红细胞。因此，根据CPV与FPV上述血凝特性差异，应用HA试验可以区别之。这与Carmichael等报道相一致。 

2．影响HA试验的因素也影响HI抗体效价。红细胞浓度较大时，HI效价较高，HI效价与血凝素剂量成正比。CPV的FPA和HI对温度、pH离子强度不如FPV那样苛刻。在4℃、22℃、37℃，pH5.8―7.4，CPV均能凝集恒河猴、猪、马和猫的红细胞。FPV依赖于4℃和pH 5.4 一6.4，但两者均以pH6.0时效价最高。血凝素以 8单位，红细胞以 0．5％为宜。试验中发现，并非每头猪红细胞均有CPV或FPV的血凝受体。因此，要注意猪红细胞的供体。在本研究中CPV不能凝集犬和绵羊红细胞，但据Senda报道，应用硼酸缓冲盐溶液和“病毒调节稀释剂”（Virus adjusting diluent，VAD），在4℃、37℃，CPV能凝集犬和绵羊的红细胞。 

3、在诊断方面， CPV、 FPV的HA活性可用于测定粪便样品中的病毒和细胞培养物中的病毒滴度，据 Carmichael等报道，凡被电镜或病毒分离证实有CPV粪便样品，也都具有较高的CPV特异性血凝素，所以需同时进行特异性血凝素，所以需同时进行特异性HA活性。正常犬粪便、CPV－HA阴性或含有冠状病毒或呼肠孤病毒的粪便都是无特异性CPV―HA活性。但粪便样品常含有低量（HA<32）的非特异性血凝素，所以需同时进行特异性HI试验。据报道，粪便中CPV的排出是短暂的，且在发病前2－3天开始排出。根据这一特点，可应用HA和HI试验对犬群进行CPV疫情监测和早期诊断，为及早预防和治疗CPV感染提供理论依据。由于该试验方法简便、快速、准确、适用于基层推广使用。 

4、凝集在猪红细胞上的CPV、FPV，在22℃、37℃，均能从红细胞上解脱下来，根据这一特点，可应用高渗氯化钠进行洗脱，以提纯、浓缩过两种病毒。

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